Методы выделения и очистки белков

Заголовок

₂
²


Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.


1. Гомогенизация – это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а) ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б) пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в) шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г) метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д) метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е) УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.

2. Экстракция белков, то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.

Экстракцию проводят:
а) растворением в 8-10% растворах солей;
б) с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в) осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.

3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:

а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.

Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов ( при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH₄)2SO₄ выпадает осадок) и альбуминов ( при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH₄)2SO₄ выпадает осадок).

На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.

Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:

, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).

Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t^o –0+8^oС), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.

Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии. Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.

Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения, который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе).

Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.

Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.

В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.

Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.

Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al₂О₃, CaCO₃, MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.



Разделение основано на том, что вещества с более высоким К_распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.

Распределительная хроматография – основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.









Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.

Методы определения Mr белков

У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):

где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
 – угловая скорость ротора (рад/с);
 – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
 – плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.

Методы определения гомогенности белков

Степень чистоты выделенного белка определяется:

• ультрацентрифугированием;
  
• методом диск - электрофореза;
  
• различными иммунохимическими методами;
  
• определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.
  

Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.